企業(yè)特殊行業(yè)經(jīng)營資質(zhì)信息公示
營業(yè)執(zhí)照已認(rèn)證
Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品能夠有效裂解各種植物器官（如葉片，根，莖，果實(shí)，種子，花），去除各種植物樣品（包括富含次生代謝物質(zhì)和多糖多酚的植物）中常見的污染，如多糖，多酚，脂類，色素，次生代謝物等，得到的高純度蛋白樣品，可以用于SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡分析以及雙向電泳（2D電泳）。
該試劑盒含有除丙酮外的其他所有試劑，使用方便，能在3小時(shí)內(nèi)得到高純度的蛋白樣品。
按照每次提取使用0.7ml試劑B計(jì)算，該試劑盒可以至少使用20次。
● 使用方法：
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備材料：
液氮；研缽；1.5ml離心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴鍋；干浴器；冷凍離心機(jī)；制冰機(jī)；渦旋振蕩器。
I 樣品破碎：
1. 取植物樣本（每個(gè)樣本取0.2-0.5克），在液氮條件下，用研缽充分研磨成粉末。
注：此步驟非常重要，樣本研磨越細(xì)越好，研磨不徹底會(huì)導(dǎo)致蛋白濃度偏低。
II 沉淀雜質(zhì)：
2. 取1.5 ml離心管，加入1 ml即用型試劑A（按照下表配制），迅速將粉末加入其中，漩渦混勻，RT 放置5分鐘。
即用型試劑A-樣本雜質(zhì)去除劑配制
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即用型試劑A |
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1個(gè)樣品 |
2個(gè)樣品 |
n個(gè)樣品 |
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試劑A-樣本雜質(zhì)去除劑 |
0.5 ml |
1 ml |
n×0.5 ml |
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丙酮 |
0.5 ml |
1 ml |
n×0.5 ml |
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DTT（100×） |
10 μl |
20 μl |
n×10 μl |
3.12000g4℃離心5分鐘，去除上清，保留沉淀。
注：觀察沉淀顏色，如沉淀顏色為綠色，繼續(xù)步驟4；如沉淀顏色為淺色或白色，跳過步驟4，直接進(jìn)行步驟5。
4. 沉淀中加入1 ml即用型試劑A，漩渦混勻，RT放置5分鐘，12000g4℃離心5分鐘。
5. 沉淀中加入1 ml 預(yù)冷的丙酮（自備，試劑盒不提供）和10 μl DTT溶液，漩渦震蕩（此時(shí)溶液狀態(tài)應(yīng)為白色懸液），徹底重懸，12000g4℃離心5分鐘，去除上清，收集沉淀。
6. 快甩離心數(shù)秒，殘留上清用移液器徹底吸棄，沉淀物通風(fēng)晾干1-2分鐘至沉淀干燥。
注：沉淀不能過分干燥，否則會(huì)影響以下步驟蛋白的溶解性。
III 蛋白粗提：
7. 蛋白沉淀中加入0.7 ml 即用型試劑B（按照下表配制），漩渦震蕩，徹底重懸沉淀（此時(shí)溶液狀態(tài)為淡藍(lán)色的懸浮溶液）；70℃水浴1小時(shí)，間歇混勻。
即用型試劑B-植物蛋白提取緩沖液配制：
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即用型試劑B |
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試劑B-植物蛋白提取緩沖液II |
0.7 ml |
5 ml |
10 ml |
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蛋白酶抑制劑混合物（100×） |
7 μl |
50 μl |
100 μl |
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DTT（100×） |
7 μl |
50 μl |
100 μl |
8.12000g4℃離心10分鐘，小心取上清（通?？扇?00 μl，溶液為淡藍(lán)色）于1.5ml離心管中，不要吸取沉淀。
注：此步驟得到的蛋白溶液可以進(jìn)行大多數(shù)蛋白實(shí)驗(yàn)，如WB。如要進(jìn)行雙向電泳（2D電泳）實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)以下步驟。
IV 蛋白純化：
9. 加入與上清等體積的試劑C（注：試劑C上層為保護(hù)相，應(yīng)該吸取下部的淡黃色液體），劇烈顛倒震蕩后常溫放置1-2分鐘，12000gRT 離心5分鐘，溶液分成兩層，上層溶液為藍(lán)色，蛋白位于下層溶液中。
注：試劑C有腐蝕性，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥內(nèi)操作，注意防護(hù)。
10. 用一次性注射器小心吸取下層溶液（通?？扇?50 μl）于1.5 ml離心管中，加入等體積試劑D，劇烈顛倒混勻，12000gRT 離心5分鐘，蛋白位于上層溶液中，收集上層溶液（通?？扇?50-200 μl）于1.5ml離心管中。
V 蛋白沉淀：
11. 蛋白溶液中加入5倍體積溶液E，顛倒混勻，此時(shí)可見有絮狀沉淀生產(chǎn)，-20℃ 沉淀30分鐘。
注：微量蛋白的提取可以-20℃過夜沉淀。
12.12000g4℃離心10分鐘，收集蛋白沉淀，去除上清。
注：正常的蛋白沉淀接近無色，如顏色為褐色或淡黃色說明蛋白不純，不能用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)。重復(fù)步驟7-12，直至蛋白沉淀接近無色。
13. 沉淀中加入1ml 溶液E，徹底重懸沉淀，12000rpm4℃離心5分鐘，棄上清。
14. 沉淀中加入1ml預(yù)冷的80%丙酮（自備，試劑盒不提供）和10 μl DTT，徹底重懸沉淀，12000g4℃離心5分鐘，棄上清。
15. 快甩離心數(shù)秒，殘留上清移液器徹底吸棄，沉淀物通風(fēng)晾干1-2分鐘至沉淀干燥。
注：沉淀不能過分干燥，否則不好溶解。
VI 蛋白溶解：
17. 沉淀中加入適當(dāng)體積樣品緩沖液溶解，-20℃或-80℃貯存。
注： ① 如進(jìn)行雙向電泳，樣品溶于雙向電泳樣品緩沖液中；如進(jìn)行單向電泳，樣品溶于1×SDS-PAGE 上樣緩沖液中。
② 由于提取過程中使用了DTT，為了避免DTT對(duì)蛋白濃度測(cè)定的干擾，蛋白定量時(shí)盡量選擇Bradford方法。
