產(chǎn)品簡介：

支原體染色檢測試劑盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一種經(jīng)典的利用DNA熒光染色法檢測支原體污染的試劑盒，其原理是當細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮，Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。??

產(chǎn)品組成：

自備材料：?

1、 可觀察藍光的熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡

2、 PBS或生理鹽水

3、 載玻片、蓋玻片?

4、 預冷固定液：預冷的70%乙醇或4%****

使用說明：

1． 細胞樣品的準備：

a. 對于貼壁細胞，在六孔板或其它多孔板內(nèi)或蓋玻片上培養(yǎng)細胞至50%-80%滿。

細胞培養(yǎng)過滿會導致很難判斷是否存在支原體污染。

b. 對于懸浮細胞，離心沉淀細胞，取少量細胞做細胞涂片，空氣中充分晾干。

2． 用PBS按照1:10稀釋Hoechst染色液(1體積Hoechst染色液加入9體積PBS)。

稀釋后的Hoechst染色液宜在24小時內(nèi)使用。

3． 加適量固定液固定10-20分鐘。

對于六孔板的一個孔，加入1ml固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對細胞進行洗滌。另外對于貼壁細胞，固定前需去除培養(yǎng)液。

4． 去除固定液，空氣中晾干。

5． 加適量10倍稀釋的Hoechst染色液室溫染色10-30分鐘。

對于六孔板的一個孔，加入1ml染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時注意避光。可以用鋁箔紙避光。

6． 去除染色液，空氣中晾干。

7． 滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍色熒光。

檢測效果對比圖：

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本試劑盒的檢測效果圖參考上圖。左圖為無支原體污染情況，中圖為支原體輕度污染情況，箭頭所指為微粒狀的一些支原體，右圖為支原體重度污染情況，可見大量微粒狀的支原體。

熒光顯微鏡觀察時需400倍或1000倍放大觀察(需使用油鏡)。參考上圖判斷支原體污染情況。沒有支原體污染或其它原核生物污染的細胞樣品，僅觀察到細胞核的藍色熒光，線粒體DNA不會被染色。有支原體污染的細胞樣品可以觀察到細胞核周圍微粒狀或絲狀藍色熒光。支原體污染嚴重的細胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍色熒光。有細菌、酵母或霉菌污染的情況雖然Hoechst染色也會呈陽性，但細菌、酵母或霉菌污染在光學顯微鏡下可以觀察到，而支原體觀察不到，由此可以初步區(qū)分是支原體還是其它微生物。如有必要進一步鑒定，可以通過把支原體接種培養(yǎng)和RT-PCR等方法進行進一步檢測。