多能干細(xì)胞(ES/iPS)凍存是干細(xì)胞擴(kuò)增傳代過程中重要的一環(huán)，但是多能干細(xì)胞不同于普通細(xì)胞系，其增殖擴(kuò)增過程中需要聚團(tuán)生長，為保持其細(xì)胞活性，不建議單細(xì)胞傳代。而且使用血清+DMSO凍存方法，不能很好的保持細(xì)胞活性，且復(fù)蘇細(xì)胞成活率較低。本文就重點介紹多能干細(xì)胞進(jìn)行凍存以及解凍的標(biāo)準(zhǔn)化步驟。     

   介紹使用AppliedCell? 多能干細(xì)胞培養(yǎng)基以及Advance多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞， 　

   本方法適用于AppliedCell? 多能干細(xì)胞培養(yǎng)基以及Advance多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞（同樣適用于mTesR以及E8系統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞），凍存以及復(fù)蘇前后，應(yīng)當(dāng)使用同一種培養(yǎng)基，復(fù)蘇傳代后可以更換其他培養(yǎng)體系。             Serum-Free干細(xì)胞凍存液（AC-1001011/12）是埃澤思生物專為ES/iPS  細(xì)胞設(shè)計的的一款化學(xué)成分確定，無血清，無動物源成分，且無需程序降溫的**凍存液。具體凍存及復(fù)蘇操作方法如下：          

1、凍存：以下操作方法以6孔板為例： 　　

（1） Serum-Free干細(xì)胞凍存液為即拿即用，且4℃保存，凍存液拿出后應(yīng)快速放回4℃； 　　

（2）使用多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）消化細(xì)胞；          

（3）收集細(xì)胞，室溫300×g離心5分鐘； 　　

（4）小心吸掉上清液，不要干擾細(xì)胞團(tuán)； 　　

（5）用1mL凍存液重懸細(xì)胞，并均勻分裝到凍存管中 　　

采用非程序降溫法，將凍存管直接放入-80℃冰箱中，凍存24h后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存?！　? 　　

2、解凍 　　

預(yù)先包被細(xì)胞培養(yǎng)板，人ES和iPS細(xì)胞解凍后應(yīng)立即接種到培養(yǎng)板中。 　　

（1）多能干細(xì)胞培養(yǎng)基/Advance 多能干細(xì)胞培養(yǎng)基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱; 　　          

（2）在水浴鍋中持續(xù)晃動凍存管，37℃水浴鍋中快速解凍細(xì)胞，直至細(xì)胞完全融化；　          

（3）取出凍存管，用70％乙醇擦拭凍存管表面； 　　

（4）準(zhǔn)備15mL離心管，預(yù)先加入5mL多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中，盡量保持細(xì)胞聚團(tuán)狀態(tài)。 　　

（5）在室溫300×g離心5分鐘。 　　

（6）吸掉上清，注意不要干擾細(xì)胞沉淀。使用1mL多能干細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕地重懸細(xì)胞3-5次，不要破壞細(xì)胞聚團(tuán)狀態(tài)。 　　

（7）分別取0.5mL細(xì)胞懸液，均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中，并分別補(bǔ)充多能干細(xì)胞培養(yǎng)基至2m。 　?。?）置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在前后左右呈十字形搖動培養(yǎng)板板5次，以均勻分散細(xì)胞。 　　

（9）每天更換培養(yǎng)基，并顯微鏡下觀察細(xì)胞狀。